Nat Commun︱选择性抑制小胶质细胞活化有望缓解病理性α-syn传播
撰文︱Sucre
责编︱王思珍
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是目前世界上第二大神经退行性疾病，全球超过610万人罹患PD【1】。PD是由投射到纹状体的黑质多巴胺能神经元进行性死亡缺失，引起以纹状体中多巴胺水平下降和运动障碍为典型特征的神经退行性疾病，PD的标志性病变是α-突触核蛋白发生病理性聚集，形成路易小体（Lewy bodies，LBs）和路易突起（Lewy neurites，LNs）【2】。
α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）在散发性和家族性PD的病理进程中都扮演着重要作用。遗传学研究发现，编码α-syn的基因拷贝数增加，引起内源性α-syn水平升高，是导致家族早发性PD的直接原因。编码α-yn的基因突变也是导致家族性PD的另一直接原因【3】。此外，α-syn参与包括PD，路易小体痴呆（dementia with Lewy bodies，DLB）和多系统萎缩（multiple system atrophy，MSA）等多种神经退行性疾病的发生发展【4】。鉴于α-syn在PD等多种疾病中的重要作用，因此，靶向α-syn传播是一种潜在的干预手段。
此前研究表明，神经元通过胞吐作用将胞内病理性α-syn释放，并被周围胶质细胞和神经元摄取，同时引起慢性炎症【5, 6】。作为中枢神经系统的重要免疫细胞，小胶质细胞（microglia）在介导炎症反应、清除细胞碎片方面具有重要作用【7】。同时，研究表明，病理性α-syn聚集往往伴随着小胶质细胞活化【8】。然而，人们尚不清楚小胶质细胞调控病理性α-syn传播的分子机制。
近日，来自美国拉什大学医学中心（Rush University Medical Center）的Kalipada Pahan团队在Nature Communications上发表了题为“Selective targeting of the TLR2/MyD88/NF-κB pathway reduces α-synuclein spreading in vitro and in vivo”的最新研究论文。研究发现，预制α-syn原纤维通过促进TLR2与MyD88互作，引起小胶质细胞活化。选择性抑制TLR2/MyD88/NF-κB通路，不仅可以缓解预制α-syn原纤维诱导的小胶质细胞活化和炎症反应，同时能够抑制病理性α-syn传播。
文中，作者首先研究了预制α-syn原纤维（preformed α-syn fibrils，PFF）对小胶质细胞中TLR2（Toll like receptor 2）的激活作用。为此，作者首先制备出能够诱导内源性α-syn发生病理性聚集的PFF，并借助电镜和生化手段对其分别进行结构和分子量检测。接着，作者发现，PFF处理后的BV-2小胶质细胞，TLR2与MyD88（Myeloid differentiation factor 88）之间的互作增强，同时，wtTIDM（wild type TLR2-interacting domain of MyD88）多肽而非mTIDM（mutant TLR2-interacting domain of MyD88）多肽能够显著抑制这种相互作用。考虑到TLR2-MyD88互作增强能够引起NF-κB的活化，同时NF-κB是一种促炎转录因子，因此作者检测了NF-κB的活性以及炎症因子的转录水平，结果发现，NF-κB的DNA结合活性和NF-κB的转录活性都明显升高，同时iNOS和IL-1β炎症因子的转录水平也显著升高，并且上述效应能够被wtTIDM而非mTIDM显著抑制。这些结果表明，PFF能够诱导小胶质细胞TLR2激活，从而引起NF-κB活性升高以及炎症因子转录水平升高，并且这一过程能够被wtTIDM有效抑制。
考虑到小胶质细胞在中枢神经系统通过吞噬作用，发挥降解细胞碎片和聚集蛋白的功能，因此，作者研究了TLR2对小胶质细胞吞噬作用的影响。为此，作者将小胶质细胞中TLR2敲除，通过荧光标记单体α-syn的方法检测其吞噬作用，结果发现TLR-/-小胶质细胞的吞噬能力明显下降。有趣的是，wtTIDM处理的野生型小胶质细胞的吞噬作用相比对照组没有明显变化，这一现象在LPS处理的小胶质细胞中也类似，虽然LPS处理后吞噬水平整体都有一定程度的升高。这些结果表明，虽然敲除TLR2会影响小胶质细胞的吞噬能力，但特异性阻断TLR2与MyD88互作并不会影响小胶质细胞的吞噬作用。
（图片引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
综合上述结果，体外条件下，选择性抑制TLR2活化可以实现在不影响小胶质细胞吞噬能力的情况下，有效阻断PFF诱导的炎症反应（图1）。
接着，作者研究了在体条件下，TLR2选择性抑制剂wtTIDM对PFF诱导的炎症反应的影响。为此，作者首先通过立体定位仪将PFF注射到 A53T（α-syn N端的一个点突）转基因小鼠的纹状体内囊区【9】，注射2个月后，开始通过鼻腔给予wtTIDM多肽，持续1个月，然后进行生化指标检测，结果显示wtTIDM处理的小鼠相比对照组小鼠，SN区域的胶质细胞活化增生水平及炎症因子水平都受到显著抑制。这些结果说明，在体条件下，TLR2选择性抑制剂wtTIDM，能够显著抑制PFF诱导的胶质细胞炎症反应。
此前研究表明，胶质细胞的活化往往伴随着病理性α-syn的传播【10】。接着，作者研究了在体条件下，TLR2选择性抑制剂wtTIDM对病理性α-syn传播的影响。类似地，作者将PFF注射到小鼠的纹状体内囊区，实验组鼻内给予wtTIDM，对照组鼻内给予mTIDM，然后对黑质和运动皮层中不可溶性α-syn和α-syn丝氨酸129位点磷酸化（pSyn129）水平进行检测，结果显示，相比mTIDM，wtTIDM处理的小鼠，黑质、运动皮层中不可溶性α-syn和pSyn129的水平显著下降。这些结果说明，鼻内给予TLR2选择性抑制剂wtTIDM，能够有效阻止脑内病理性α-syn的传播（图2）。
图2 TLR2选择性抑制剂wtTIDM能够有效阻止脑内病理性α-syn传播
（图引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
另外，此前研究表明，PFF能够引起黑质多巴胺能神经元死亡，同时伴随炎症反应。基于上述结果，即wtTIDM能够有效阻止脑内病理性α-syn传播，接着，作者开展了wtTIDM对多巴胺能神经元保护作用的研究。借助免疫组化、蛋白质印记、高效液相色谱和行为实验等手段，作者发现，纹状体内囊区注射PFF 3个月后，A53T小鼠黑质中的caspas3活性升高、TH表达水平明显下降、TH阳性神经元显著缺失、纹状体中多巴胺水平下降并伴随运动障碍，而鼻内给予wtTIDM能够显著缓解上述病理过程。同时，在老年A53T小鼠中，wtTIDM对PFF引起的病理变化和运动异常也有类似的改善作用。这些结果说明，wtTIDM能够有效保护PFF引起的神经元死亡、延缓PFF引起的病理变化和改善运动障碍（图3）。
图3 wtTIDM能够有效保护PFF引起的神经元死亡、延缓病理变化和改善运动障碍
（图引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
接着，为了进一步确认TLR2在病理性α-syn传播中的作用以及wtTIDM发挥的上述一系列保护作用是TLR2依赖性的，作者将A53T+/+小鼠和TLR2-/-小鼠杂交，获得TLR2敲除的A53T转基因小鼠，即A53TΔTLR2。类似地，在纹状体内囊区注射PFF 3个月后进行病理检测，结果显示，相比A53T小鼠，A53TΔTLR2小鼠黑质、运动皮层中的不溶性α-syn和pSyn129水平显著降低，同时伴随较低水平的胶质细胞炎症水平。有趣的是，与A53T小鼠不同的是，鼻内给予wtTIDM不能进一步降低A53TΔTLR2小鼠黑质中病理性α-syn水平和炎症反应。这些结果证明，功能性TLR2缺失显著影响病理性α-syn传播，同时wtTIDM发挥的一系列保护作用是TLR2依赖性的（图4）。
图4 功能性TLR2缺失显著影响病理性α-syn传播
（图引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
接着，作者深入研究了TLR2参与α-syn病理变化的分子机制。α-syn的表达是病理性α-syn形成的前提条件，然而我们尚不清楚小胶质细胞来源的促炎因子，比如IL-1β，TNFα能否影响α-syn的表达。为了解决这一问题，作者将促炎因子IL-1β，TNFα分别加入到MN9D神经细胞中，结果发现，经IL-1β或TNFα处理的神经细胞，α-syn的表达水平都明显升高，并且呈现剂量依赖性。这些结果说明，促炎因子能够提高神经细胞中α-syn表达水平。
接着，作者深入研究了促炎因子提高神经细胞中α-syn表达水平的分子机制。首先，作者利用促炎因子处理MN9D神经细胞，结果发现，处理后细胞的NF-κB DNA结合活性和转录活性都明显升高，同时，利用NF-κB活化的特异性抑制剂wtNBD处理神经细胞，能够明显抑制IL-1β和TNFα诱导的α-syn水平上调。进一步地，作者通过检索MatInspector发现，NF-κB能够结合α-syn基因的启动子，因此作者推测NF-κB可能通过转录水平实现对α-syn表达的调节。为此，作者将α-syn基因启动子上的NF-κB关键结合位点进行突变，结果发现，IL-1β和TNFα处理后的神经细胞失去上调α-syn表达水平的能力。同时，作者发现，炎症因子处理后的神经细胞，p65、p50、CBP、p300和RNA Pol被募集到α-syn基因的启动子，从而提高α-syn基因启动子的转录活性。同样地，促炎因子处理的人SH-SY5Y神经细胞也有上述一系列表型。值得一提的是，促炎因子IL-1β和TNFα对α-syn表达的调节作用具有普适性，即其他多种促炎因子，如MPP+、LPS、Tat、poly IC和ODN等均可通过活化NF-κB，上调α-syn表达水平。这些结果说明，促炎因子通过活化NF-κB，提高α-syn基因启动子的转录活性，从而实现神经细胞中α-syn表达水平上调（图5）。
图5 促炎因子通过活化NF-κB，提高α-syn基因启动子的转录活性，上调α-syn表达水平
（图引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
随后，作者进一步探究了小胶质细胞来源的促炎因子对多巴能神经元α-syn表达水平的影响。首先，作者利用PFF刺激原代小胶质细胞，然后将刺激后的小胶质细胞和原代中脑多巴胺能神经元进行共培养。结果发现，多巴胺能神经元中的NF-κB活性明显升高，同时伴随α-syn mRNA水平和蛋白水平上调，并且这一结果可以被wtTIDM抑制。紧接着，上述结果在体内条件下也得以重复。因此，这些结果证明，PFF诱导小胶质细胞释放的促炎因子，通过激活多巴胺能神经元NF-κB上调α-syn表达水平，并且这一过程能够被wtTIDM有效抑制（图6）。
图6 PFF通过促炎因子激活多巴胺能神经元中NF-κB，上调α-syn表达水平
（图引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
综合上述结果，PFF通过诱导TLR2活化引起小胶质细胞释放促炎因子，接着促炎因子通过激活NF-κB上调α-syn表达。因此，作为导致α-syn表达上调的直接原因，NF-κB可能可以作为调控病理性α-syn传播的有效靶点。为此，作者通过鼻内给予NF-κB活化的特异性抑制剂wtNBD，随后对NF-κB的活化状态和病理性α-syn的传播情况分别进行检测，结果显示，鼻内给予wtNBD能够有效抑制NF-κB的活化和病理性α-syn在黑质和运动皮层的传播，同时能够有效保护多巴胺能神经元和改善运动症状。因此，这些结果表明：在PFF诱导的A53T PD小鼠模型中，NF-κB特异性抑制剂wtNBD能够有效抑制病理性α-syn传播和改善运动障碍（图7）。
图7 NF-κB特异性抑制剂wtNBD能够有效抑制病理性α-syn传播和改善运动障碍
（图引自：Dutta D, et al., Nat Commun. 2021）
病理性α-syn在PD，DLB和MSA等突触核蛋白病（synucleinopathies）中呈朊病毒样传播。然而，一直以来，人们对于病理性α-syn的传播机制尚不清楚。文中，作者发现PFF通过加强TLR2与MyD88互作，激活NF-κB，诱导小胶质细胞活化和促炎因子表达水平上调。利用TLR2/MyD88/NF-κB通路选择性抑制剂，即wtTIDM和wtNBD，分别选择性抑制TLR2与MyD88互作和NF-κB活化，均可显著抑制PFF引起的炎症反应并减轻病理性α-syn传播。值得一提的是，这一过程在in vitro 和 in vivo条件下，效果都很显著。因此，TLR2/MyD88/NF-κB通路可能具有作为干预PD等疾病进程的重要靶点，同时wtTIDM和wtNBD有望成为干预治疗PD等神经退行性疾病的药物，而且，这两种多肽均可以通过血脑屏障，鼻内给药即可，具有天然的给药优势。
文中，作者详细研究了PFF对小胶质细胞的影响并探讨了潜在的干预手段。那么，作为中枢神经系统中另一类重要的免疫细胞，星形胶质细胞，PFF能否引起上述类似的信号通路激活？是一个值得研究的问题。
另外，作者发现，除了PFF，其他比如IL-1β、TNFα、LPS、poly IC等多种促炎分子都是通过激活NF-κB通路，上调α-syn表达，并促进病理性α-syn传播。截然不同的是，IFNγ不通过NF-κB通路，也可激活α-syn激动子，上调α-syn表达，并促进病理性α-syn传播。这一结果暗示我们，除了NF-κB通路外，可能还存在其他炎症转录因子参与α-syn表达上调。
总之，该研究揭示了PFF通过促进TLR2与MyD88互作，引起小胶质细胞活化。选择性抑制TLR2/MyD88/NF-κB通路，不仅可以缓解PFF诱导的小胶质细胞活化和炎症反应，同时能够抑制病理性α-syn传播。这项研究工作，加深了我们对小胶质细胞调控病理性α-syn传播的理解，也为干预PD等疾病进展，提供了潜在的治疗靶点和药物。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-25767-1
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1 Feigin, V. L. et al. Global, regional and national burden of neurological disorders, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol. 18, 459–480 (2019).
2 Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM, et al. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388(6645):839-840 (1997).
3 Hofer, A. et al. The role of alpha-synuclein gene multiplications in early-onset Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. J. Neural Transm. 112, 1249–1254 (2005).
4 Bayer, T. A. et al. Alpha-synuclein accumulates in Lewy bodies in Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies but not in Alzheimer’s disease beta amyloid plaque cores. Neurosci. Lett. 266, 213–216 (1999).
5 Lee, H. J., Bae, E. J. & Lee, S. J. Extracellular alpha–synuclein-a novel and crucial factor in Lewy body diseases. Nat. Rev. Neurol. 10, 92–98 (2014).
6 Desplats, P. et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 13010–13015 (2009).
7 Colonna, M., and Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu. Rev. Immunol. 35, 441–468 (2017).
8 Heneka, M.T., Kummer, M.P., and Latz, E. Innate immune activation in neurodegenerative disease. Nat. Rev. Immunol. 14, 463–477 (2014).
9 Lee, M. K. et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson’s disease-linked Ala-53–> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 8968–8973 (2002).
10 Yun, S. P. et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson’s disease. Nat. Med. 24, 931–938(2018).
制版︱王思珍
本文完